Es ist Nacht im Smithsonian in Washington, D.C. Die Museumsführer sind nach Haus gegangen, die Lichter sind gelöscht, die Schulkinder liegen längst in ihren Betten...doch geht irgendetwas Unglaubliches dort vor sich. Etwas, das den ehemaligen Nachtwächter Larry Daley (Ben Stiller) in sein großartigstes, aufregendstes Abenteuer stürzt - die Geschichte wird erneut lebendig, von den weltberühmten Gemälden an der Wand über die Statuen der Vergangenheit bis hin zu den Raketen im Air & Space Museum.
In der Fortsetzung der NACHTS IM MUSEUM-Saga muss sich Larry einem so heldenhaften Kampf stellen, dass nur der größte Museumskomplex der Welt als Ort dafür in Frage kam. Larry und seine alten Museumsfreunde tragen mitten im Smithsonian eine Schlacht aus, die ihre letzte sein könnte.

Dabei hat Larry seinen schlecht bezahlten Job als Museumsnachtwächter mittlerweile eigentlich an den Nagel gehängt und ist ein erfolgreicher Geschäftsmann geworden. Es mangelt ihm an nichts - und doch scheint ihm etwas zu fehlen. Etwas, das ihn dahin zurücklockt, wo er die magischste und aufregendste Nacht seines Lebens verbracht hat: Zum New Yorker Museum of Natural History. Dort macht er eine beunruhigende Entdeckung. Seine treuen Museumsfreunde von damals gelten plötzlich als altmodisch. Sie warten in Kisten verpackt darauf, auf Nimmerwiedersehen im unendlichen Archiv des Smithsonian in Washington zu verschwinden.
Ihr Schicksal ist ungewiss - bis zu dem Moment, als Larry einen Notruf des Miniatur-Cowboys Jedediah (Owen Wilson) erhält, der furchtbare Neuigkeiten hat. Versehentlich wurde auch ihr neues Zuhause zum Leben erweckt, inklusive des ägyptischen Herrschers Kahmunrah (Hank Azaria), der nach seinem dreitausendjährigen Schlaf besonders schlecht drauf ist. Gemeinsam mit drei der abscheulichsten Bösewichte der Geschichte - Iwan dem Schrecklichen (Christopher Guest), Kaiser Napoleon (Alain Chabat) und Al Capone (Jon Bernthal) - will er die Armeen der Unterwelt auf das Museum (und danach auf die ganze Welt) loslassen.
Eilig reist Larry nach Washington, ist aber von der Situation heillos überfordert. Gut, dass ihm ein paar grandiose neue Freunde zur Seite stehen - vom brillanten Albert Einstein über den ehrenwerten Präsidenten Abraham Lincoln bis zu der unwiderstehlichen Amelia Earhart (Amy Adams), die Larrys Abenteuerlust und Lebensfreude neu entfacht. Gemeinsam mit seinen alten Freunden Präsident Teddy Roosevelt (Robin Williams), Octavius (Steve Coogan), Sacajawea (Mizuo Peck), Attila dem Hunnen (Patrick Gallagher) und den Neanderthalern gibt Larry alles, um die Bösen zu besiegen und die Ordnung im Museum wiederherzustellen...
Das Action-Abenteuer NACHTS IM MUSEUM 2 ist der erste Film, der im Smithsonian Museumskomplex gedreht werden durfte, dem bedeutendsten Museum der USA und dem größten sowie meistbesuchten Museum der Welt.